如何减少冷冻切片中的冰晶

一、原理

冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。而冰冻切片和石蜡切片的区别，简单来说石蜡切片用于进行免疫组化实验，冰冻切片则常用于免疫荧光实验。

在冰冻切片中，组织中水分易形成冰晶，往往影响酶和抗原的定位。

而冰晶的形成原理，生物体是由细胞构成的，细胞中水分约占80%～90%，水在各种组织中含量最多。因为水在结冰时因 键的交联而膨胀，所以待检的标本在冷冻过程中，水份很容易形成冰晶，使切片出现大量冰晶孔隙以及大小空泡，造成冷冻假象。在含水量较多的组织中更易发生。

冰晶的形成受到温度的影响，且与其生长速率（指冰晶的大小）成正比，而与形成速率（成核率，指冰晶形成的个数）成反比，已有文献表明，冰晶形成速率较慢，以后逐渐增加，其临界温度为-3.3℃。从-3.0℃降至-4.3℃之间，形成速率急剧增加，然后再减慢。因此，在制片时首先必须做到组织在极短的时间内骤冷速冻，才能保证镜下观察时没有冰晶干扰，组织结构才能清晰，细胞形态才能完好。

二、如何减少冰晶的形成

1．机器温度范围:低温恒温器机器通常的温度范围从0度到-35℃之间最正确的组织切片的-15℃和-25℃。含有水分较高的组织采用稍微高的温度,富含脂肪的组织需要较低的温度。

2. 在进行免疫荧光之前，组织需要灌流，后固定，蔗糖脱水和包埋。其中最关键的步骤是蔗糖脱水，也是减少冰晶形成的必选过程。蔗糖脱水利用的是组织样本和溶剂的浓度差，将组织样本中的水析出，一般用30%蔗糖（溶剂为PBS）浓度直接室温脱水3天，24h更换糖水。可以通过组织快速沉底来判断是否脱水彻底。

3. 组织需要速冻，将包埋好的组织快速放在-80℃进行速冻，缩短时间，减少冰晶的形成，或者液氮速冻1-2分钟。当要进行切片时需先将组织放在-20℃进行回温，然后开始进行切片。

4. 切片的保存，短期在PBS中，-4℃，长期需放在冻存液中，-20℃。